摘要 [摘 要] 旨在采用高通量测序技术研究一种用于猪场污水处理的新型发酵床系统的微生物多样性。分别对发酵床表层、中层、深层细菌的16SrDNA 和真菌的ITS进行序列测定，分析各层次发酵
[摘 要] 旨在采用高通量测序技术研究一种用于猪场污水处理的新型发酵床系统的微生物多样性。分别对发酵床表层、中层、深层细菌的16SrDNA 和真菌的ITS进行序列测定，分析各层次发酵床中的微生物群落结构特征。结果表明，细菌平均每层获得 OTUs36899.33个，真菌平均每层获得 OTUs37129.33个。物种分类的结果显示，细菌隶属于24门43纲95目197科 390 属 529 种，其 中 的 优 势 菌 群 为 变 形 菌 门 (Proteobacteria)和 拟 杆 菌 门 (Bacte-roidetes)，它们的相对丰度分别为45.96%和28.79%。真菌隶属于4门6纲11目15科18属，优势菌群为子囊菌门(Ascomycota)和柄孢壳属(Zopfiella)，其相对丰度分别为59.18%和62.34%。发酵床中层的微生物多样性远高于表层和深层，细菌的多样性和丰富度远高于真菌。研究表明在不同深度的发酵床垫料中微生物的丰富度、多样性、相似性、优势菌群均有不同。
[关键词] 发酵床;细菌多样性;真菌多样性;高通量测序;猪场污水
中国是世界上最大的生猪养殖和猪肉消耗国，据国家统计局2017年统计数据，中国生猪2017年出栏量为68861万头，猪肉产量达5340万t，出栏数和 猪 肉 消 费 量 均 约 占 世 界 总 量 的 50% 左 右[1]。随着规模化养猪的快速发展，区域内粪污排放量急剧增加，处理不当常导致严重的环境污染问题[2]，并成为制约养猪业进一步发展的主要因素之一。源于日本的发酵床养猪模式由于其 污 水 零 排 放 的 特点[3]，在国内得到了快速推广。但在推广的 过 程 中发现发酵床养猪模式存在垫料采购困难、有害元素超标、需要定期翻堆和容易死床等诸多缺陷，国内科技人员在此基础上开发了新型发酵床粪污处理系统。赖贻奎等[4]报道了湖南浏阳的室外(异位)发酵床粪污处理模式，俸祥仁等[5]报道了一种适合南方气候的高床式发酵床粪污处理模式。这两种改良的发酵床粪污处理模式最大的优点是猪群不再与发酵床接触，有利于采用机械自动翻耙;同时猪群的饲养管理和消毒等也较传统发酵床更为方便。在发酵床污水处理技术的基础上，许道军开发了一种新型发酵床污水处理系统[6](图1，图2)，包括发酵子系统、蒸发子系统和布液子系统。液态污水通过水泵和布水管进入蒸发膜，由于蒸发膜具有巨大的表面积，能够保证污水溶氧量显著增加，有助于好氧微生物大量增殖，吸附消纳污水中的营养物质;同时蒸发膜巨大的表面积有助于污水在蒸发膜表面蒸发。多余的污水沿蒸发膜下流到发酵子系统内，被发酵池垫料中的微生物快速分解消纳，剩余的污水则通过发酵池底的缝隙流入储液池，如此循环。该系统无需对垫料进行翻耙，投资及运行费用低，操作简单，定期更换的垫料可制成优质有机肥。为了进一步研究该技术在生产实践中的各项性能，本试验采用高通量测序技术对发酵床系统的优势微生物进行相关研究，以期为该技术的全面推广应用打下基础。
1 材料与方法
1.1 样品的采集
采集地点：湖南省长沙市浏阳市普迹镇群发养殖专业合作社。试验样品：发酵床垫料由谷壳、锯末和益生菌剂组成，发酵床长21m，宽2m，发酵床垫料厚度为60cm。平均每天接纳的污水量为5.4t左右，污 水 主要由尿液和少量粪渣组成，采集样品时发酵床已运行了6个月。采集方法：采用“五点取样法”对发酵床的表层、中层、深层每层取5个样，采样时佩戴一次性无菌手套，用消毒匙在每个点取10g左右放入无菌 EP管中，然后将每一层的样品混合在一起合成一个样。样品连采3d，每天作为一个重复，共9个样，分别为表层(1-1、1-2、1-3)、中层(2-1、2-2、2-3)、深层(3-1、3-2、3-3)。样品带回实验室后用匀浆机打碎放入-80 ℃备用。采样时间：2017年4月5日-7日。
1.2 DNA 的提取与检测
采用土壤总 DNA 提取试剂盒 E.Z.N.A.SoilDNA Kit (美 国 OMEGA 公 司 )提 取 样 品 的 总DNA，分别使用紫外分光光度计(NanoDrop2000)和琼脂糖凝胶电泳判断 DNA 样品的纯度和浓度。
1.3 PCR扩增和高通量测序
对细 菌 的16SrDNA 基因 V3-V4高变 区 进 行PCR 扩 增，引 物 采 用 338F(ACTCCTACGGGAG-GCAGCAG) 和 806R (GGACTACHVGGGT-WTCTAAT)。对真 菌ITS1-ITS2 区进 行 PCR 扩增，引 物 采 用 ITS1F (CTTGGTCATTTAGAG-GAAGTAA ) 和 ITS2R (GCTGCGTTCT-TCATCGATGC)。 采 用 TransGen AP221-02：TransStartFastpfuDNA 聚合 酶，20μL 反应 体 系包括：正向引物0.8μL，反向引物0.8μL，5×Fast-PfuBuffer4μL，2.5mmol/LdNTPs2μL，FastPfu聚合酶0.4μL，BSA0.2μL，DNA 模板10ng，补ddH2O 至20μL。PCR 反应 程 序 为：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30s，55 ℃ 30s，72 ℃ 45s，循环27次;72 ℃ 10min，10℃5min。每个样本3个重复。PCR结束后将同一样本的 PCR 产物混合，2%琼脂 糖 凝 胶 电泳检测，AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收 PCR 产物，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将 PCR 产物用 QuantiFluorTM-ST蓝色 荧 光 定 量 系 统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求进行相应比例的混合。文库的建立和高通量测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。
1.4 数据处理与分析
根据index序列区分各个样本的数据，根据 PEreads之 间 的 overlap 关 系，将 成 对 的 reads 拼 接(merge)成一条序列，同时对reads的质量和 merge的效果进行质控过滤，根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列，并校正序列方向，即为优化数据。通过 Usearch 软件 对 优 化 序 列 提 取 非 重 复 序列，便于降低分析中间过程冗余计算量;去除没有重复的单序列;按 照97%相似性对非重复序列(不 含单序列)进 行 OTU 聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到 OTU 的代表序列;将 OTU 代表序列与所有选出来的优化序列进行对比，选出与代表序列相似性在97%以上的序列，生成 OTU 表格。采用 RDPclassifier贝叶斯算法对97%相似水平的 OTU 代表 序 列 进 行 分 类 学 分 析，并 分 别 在 域(domain)、界(kingdom)、门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)各个分类水平 统 计 各 样 本 的 群 落 组 成，通 过 Silva(Re-lease128http：//www.arb-silva.de)数据 库 进 行 比对[7]。选择 97% 相似 度 的 OTU 或其 他 分 类 学 水平，利用 mothur计算不同随机抽样下的多样性指数，利用 R语言工具制作曲线图。
2 结果与分析
2.1 序列统计和微生物多样性分析
发酵床垫料微生物的高通量测序分析结果见表1，表2。细菌获得的 OTUs每个样品 都 在1800以上，真菌获 得 的 OTUs只有50～75之间，从 香 农 指 数和丰富度来看，新型发酵床微生物处理系统的群落中，细菌的种类和数量远高于真菌，细菌占据了主导地位。
2.2 发酵床系统的细菌群落结构分析
对9个样本的 OTUs分类结果表明，细菌共获得序列333593个，平均每层36899.33个。隶属于24门43纲95目197科390属529种。在24个门水平中其相对丰度≧1%的共7个门(表3)。其中变 形 菌 门 (Proteobacteria)和 拟 杆 菌 门 (Bacte-roidetes)丰度 最 高，为 发 酵 床 中 细 菌 的 优 势 菌 群。其次为放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmi-cutes)、异 常 球 菌-栖 热 菌 门 (Deinococcus-Ther-mus)、浮霉菌门(Planctomycetes)等。其余17个门所占比例均少于1%。在纲水平隶属于43个不同的纲，其中相对丰度 ≧1% 的纲 只 有 13 个(表 3)，其中 黄 杆 菌 纲(Fla-vobacteriia)和 α-变 形 菌 纲 (Alphaproteobacteria)丰度最高，为样本中的优势菌群。其次为 γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、β-变 形 菌 纲 (Betapro-teobacteria)、放线 菌 纲(Actinobacteria)、噬纤 维 菌纲(Cytophagia)等。在目水平隶属于95个目，其中相对丰度≧1%的有20个，其中黄杆菌目(Flavobacteriales)在各组样品中丰度最高，平均16.07%;其次为假单胞菌目(Pseudomonadales)平 均 12.33%;伯 克 氏 菌 目(Burkholderiales)平均7.68%。在197科中，相 对丰度≧1%的有26个，其中黄杆菌科(Flavobacteri-aceae)在各组样品中丰度最高，平均13.42%;其次为假 单 胞 菌 科(Pseudomonadaceae)平均11.69%;粪产碱菌(Alcaligenaceae)平均6.14%。在属水 平 隶 属 于390个属，相 对 丰 度 ≧1%的有33个，其中假单胞菌属(Pseudomonas)在各组样品中丰度 最 高，平 均 11.26%;其次为特吕珀菌属(Truepera)平均4.76%;陶厄 氏 菌 属(Thauera)平均5.12%。虽然属水平的细菌分类较多，但是各个菌属的丰度普遍不大。
2.3 发酵床系统的真菌群落结构分析
对9个样品的 OTUs结果表明，新型发酵床污水处理系统真菌序列总数为334167个，平均每层37129.33个。隶属于4门6纲11目15科18属。在门水平相对丰度≧1%的只有2个菌门(表4)，为子囊菌门(Ascomycota)和未分类的真菌(Unclassi-fied_k_Fungi)，在门水平，其中未知的真菌很少，几乎可以忽略不计。
在纲水平隶属于6纲中，相对丰 度 ≧1%的只有2个(表4)，为粪 壳 菌 纲(Sordariomycetes)和未分类的真 菌(Unclassifiedkfungi)，其他 未 知 真 菌 在样品中的含量很少。在目水平隶属于11目，相对丰度≧1%的只有2个，为粪壳菌目(Sordariales)，平均60.23%;和未分类的真 菌(Unclassifiedkfungi)，在各 个 样 品 中 平均丰度为38.54%。在隶 属 于15科中相对丰度≧ 1%的有 2 个，为 毛 球 壳 科 (Lasiosphaeriaceae)，平均59.02%和未 分 类 的 真 菌(UnclassifiedkFungi)，在各个样品中的平均丰度为36.78%。在隶属于18属水平中，相对丰度≧1%的只有1个，为柄孢壳属(Zopfiella)在各个样品中的丰度平均 为62.34%;未分 类 的 真 菌(Unclassifiedkfun-gi)在各个样品中的平均丰度为34.54%。
3 讨 论
3.1 MIseq高通量测序技术在微生物多样性研究中的应用
自从微生物发酵床技术引入中国以来，对于发酵床的微生物研究早已有了相关的报道，但是目前有关发酵床领域的详细的微生物群落结构组成、种类、丰度和多样性的尚未有研究报道。高通量测序技术由于准确、通量高、测序范围广而使人们对土壤微生物的全面认识和了解成为可能，自2006年问世以来，已广泛应用于植物学、动物学、医学及极端环境微生物研究[7-9]。本试验亦是采用 MIseq高通量技术对新型发酵床微生物处理系统垫料的微生物体系进行了研究，发现了细菌和真菌在新型发酵床微生物处理系统不同分类、不同层次、不同深度的优势菌群及其相对丰度，并 且 对 细 菌、真 菌 的 的 门、纲、目、科、属进行了详细的分类。研究结果表明细菌在门、纲和目水平上的分类信息比较明确，在科和属水平上尚未明确分类的细菌群的比例相对较大。真菌在门、纲、目、科、属水平都有很大比例的尚未分类的菌群，且真菌类别较少，这可能与测序的区间、测序长度有关。本试 验 共 获 得 细 菌 序 列333593个，真菌序 列 334167 个，平均每个样品的序列都在 30000以上，这一结果远远高于李婧[10]采用 DGGE 指纹图谱技术获得的结果(发酵床垫料的15cm 深度序列27条、20cm 的13条)，正是因为高通 量 测 序灵敏度高才使得本试验获得的有效序列较多。
3.2 新型发酵床污水处理系统的真菌多样性
本研究发现发酵床微生物群落中真菌群落的多样性及丰度很少，而且还有大量未被分类的真菌，李志宇[20]对发酵床的微生物动态研究发现细菌无论在什么时期 的 数 量 都 远 远 高 于 真 菌。蓝 江 林 等[21]研究发现发酵床群落结构细菌丰度最高，其次是放线菌，真菌是最少的。这与本研究的结果基本符合。在发现的已 知 的 真 菌 群 落 中 子 囊 菌 门(Ascomyco-ta)的丰度最高，且只有这一个门的真菌群落。子囊菌门的真菌多为腐生菌，在自然界很常见，对发酵床垫料中的有 机 物 质 起 很 大 的 作 用。杜 东 霞 等[22]在发酵床垫料中分离到了隶属于子囊菌门的草酸青霉。肖荣凤等[23]通过 对 发 酵 床 真 菌 空 间 种 群 的 分布研究分离出真菌18个种，而种类最多的是隶属于子囊菌门的曲霉菌属。由此可见，正是这些对有机质有较大降解能力的微生物构成了发酵床的微生物发酵体系。本研究发现，新型发酵床污水处理系统的中层微生物的丰度和多样性都要高于表层和深层，究其原因可能是由于表层受到风和光照的影响比较干燥，深层由于靠近储水池，湿度较大、温度较低，不利于微生物生长，而中层由于其良好的温度和湿度比较适合微生物生长，生长条件相对比较充分，所以中层微生物的多样性和丰度是最高的。
4 结 论
(1)新型猪场污水发酵床处理系统中细菌的丰富度和多样性远远高于真菌，细菌为主要的优势菌群。(2)发酵床中层微生物的多样性和丰度比表层和深层要丰富。(3)细菌的主要优势菌群为变形菌门 (Pro-teobacteria)和拟 杆 菌 门(Bacteroidetes)，真菌 的 主要优势菌 群 为 子 囊 菌 门(Ascomycota)和粪 壳 菌 纲(Sordariomycetes)。
参考文献：
[1] 国家统计局.中国 统 计 年 鉴2017[J].北京：中国统计出版社，2017.
[2] 武深树，谭美英，黄璜，等.湖南洞庭湖区农地畜禽粪便承载量估算及其风 险 评 价 [J].中国生态农业学报，2009，17(6)：1245-1251.
[3] 王志强，沈晓昆.日本的发酵床养猪技术[J].世界农业，2004(2)：50-51.
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