摘要 摘 要：以拜耳公司的尼群地平片为参比制剂，评价云南白药集团股份有限公司尼群地平片与参比制剂的生物等效性。采用双周期自身交叉对照设计，将 16 名受试者随机分为空腹组和餐
摘 要：以拜耳公司的尼群地平片为参比制剂，评价云南白药集团股份有限公司尼群地平片与参比制剂的生物等效性。采用双周期自身交叉对照设计，将 16 名受试者随机分为空腹组和餐后组，分别于餐后及空腹服用尼群地平片，采集血浆样品，用 LC-MS/MS 测定人血浆中尼群地平的浓度，以 DAS3.3.0 软件计算药动学参数，评价尼群地平片的生物等效性。结果表明，空腹状态下受试制剂与参比制剂的主要药动学参数：Cmax 分别为 (10.78±5.32) ng·mL-1、 (9.69±8.35) ng·mL-1，AUC0-t 分别为 (53.66± 25.82) ng·h·mL-1、 (40.87±32.12) ng·h·mL-1;餐后状态下受试制剂与参比制剂的主要药动学参数： Cmax 分别为 (17.21±9.02) ng·mL-1、 (16.37±10.04) ng·mL-1，AUC0-t 分别为 (50.04±24.57) ng·h·mL-1、(54.60±28.86) ng·h·mL-1，空腹状态或餐后状态服药 Cmax、AUC 的 90%置信区间均超出 80%~125%。尼群地平两制剂不具有生物等效性，云南白药集团股份有限公司需优化尼群地平片处方和改善尼群地平片生产工艺，提高尼群地平片质量。
关键词：尼群地平;LC-MS/MS;生物等效性
尼群地平为德国拜耳公司 (Bayer Vital GmbH) 研发的二氢吡啶类钙离子拮抗剂，由于起效迅速、疗效确切、副作用小等特点，被广泛应用于治疗各类型高血压及冠心病[1]。截止 2012 年，我国已有 191 家企业仿制生产尼群地平片 [2]。为促使企业全面提高仿制药质量，国家食品药品监督管理总局 《关于开展仿制药质量一致性评价工作的通知》 中提出：“对 2007 年修订的 《药品注册管理办法》 施行前批准基本药物和临床常用仿制药，分期分批进行质量一致性评价”[3]。而生物等效性 ( bioequivalence，BE) 评价是仿制药质量与疗效一致性评价的重点内容之一[4-5]。只有仿制药与原研药具有生物等效性，临床上才可以仿制药替代原研药 [6]。本研究进行空腹状态和餐后状态下尼群地平受试制剂与参比制剂生物等效性预研究，以期获得尼群地平生物等效性评价结果，为尼群地平片生物等效性正式试验的设计提供参考和指导。
1 仪器和试药
1.1 仪器
Agilent 1200SL HPLC (美国安捷伦科技有限公司)、API3200 Q -Trap 质谱仪 (美国 AB 公司)、Allegra 64R 台式高速冷冻离心机 (美国 Beckman 公 司)、 DV215CD 电 子 天 平 (上 海 OHAUS 公司)。 1.1 药品与试剂受试制剂：尼群地平片 (云南白药集团股份有限公司，批号 ASPL201702，规格 10 mg);参比制剂：尼群地平片 (Bayer Vital GmbH，批号 BJ33777，规格 10 mg)。尼群地平对照品 (中国食品药品检定研究院，含量为 99.4%，批号： 100585 -201705) ; 内 标 ： 氘 代 尼 群 地 平(TORONTO RESEARCH CHEMICALS INC， 批号：15-BHW-78-4);甲酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。
2 试验方法
2.1 血浆样品分析方法的建立
2.1.1 血浆样品处理方法
精密量取 100 μL 血浆，置 1.5 mL 棕色离心管中，加入 200 μL 的内标沉淀剂，涡旋 3 min，于 15000 r·min-1，4 ℃离心 10 min 后，取上清液进行分析检测。 2.1.2 色谱条件与质谱条件色谱条件：色谱柱为 XBridge○R BEH C18 柱(4.6mm×75mm，2.5μm);流动相为 0.1%甲酸水- 乙腈，洗脱梯度为 0.0~2.0 min ，乙腈 10%;2.0~ 7.5 min ，乙腈 90%;7.5~12 min，乙腈 10%;柱温为 20 ℃;流速为 350 μL·min-1;进样量为 10 μL。质谱条件：电喷雾离子源 (ESI)，多反应监测 (MRM) 方式进行负离子检测，对质谱参数进行优化，优化后的质谱参数，喷雾电压 (IS)：- 4500 V， 雾 化 温 度 ( TEM) ： 600℃ ， 气 帘 气 (CUR)：30 psi，雾化气 (GS1)：85 psi，辅助气 (GS2)：60 psi，碰撞气 (CAD)：Low;尼群地平 [M-H] -母离子 m/z：359.10，定量/定性碎片离子 m/z：122.00/236.00;解簇电压 (DP)：-40V/-50 V，射入电压 (EP)：-5V/-5V，碰撞池入口电压(CEP)：-15 V/-13 V，碎裂电压 (CE)：-26V/- 25 V，碰撞室射出电压 (CXP)：-2 V/-2 V;氘代尼群地平 [M-H] -母离子 m/z：364.10，定量/ 定 性 碎 片 离 子 m/z： 122.00/241.10; 解 簇 电 压(DP)：-50V/-50 V，射入电压 (EP)：-5V/-5 V，碰撞池入口电压 (CEP)：-15 V/-15 V，碎裂电 压 (CE)： -27 V/25 V， 碰 撞 室 射 出 电 压(CXP)：-2 V/-2 V。
2.2 溶液的配置
精密称定尼群地平对照品 5.84mg 于 10 mL 棕色容量瓶，用乙腈溶解并定容稀释成浓度分别为 1.97、4.93、14.8、44.3、133、400ng·mL-1 的标准曲线工作液;同法精密称定尼群地平对照品 5.26mg 和内标氘代尼群地平对照品 2.60 mg 用乙腈 分 别 稀 释 成 质 量 浓 度 分 别 为 3.90、 82.0、 328ng·mL-1 的质控工作液和质量浓度为 2.08 ng· mL-1 的内标沉淀剂。
2.3 分析方法的确证
2.3.1 特异性
测定空白血浆样品、空白血浆加标样品及任一志愿者服药后的未知浓度血浆样品，由尼群地平、氘代尼群地平定量离子对 (m/z359.10 →m/ z122.00、m/z 364.10 →m/z122.00) 的提取离子流图可知，血浆中内源性物质和代谢物不干扰尼群地平和内标的测定，方法的特异性良好。
2.3.2 标准曲线及定量下限
配制血药质量浓度为 0.197、0.493、1.48、 4.43、13.3、40.0 ng·mL-1 的标准曲线样品，进样检测，得标准曲线回归方程为 Y=0.284X+0.00962 (r=0.9996)，结果表明，尼群地平血药质量浓度在 0.197~40.0 ng·mL-1 范围内线性关系良好，定量下限为 0.197 ng·mL-1。
2.3.3 精密度与准确度
处理定量下限、低、中、高 4 个质量浓度(0.197、0.390、8.20、32.8 ng·mL-1) 的血浆样品各 6 份，连续 3 天，进样检测，得批内准确度为 88.32%~111.28 %，批内精密度为 RSD%为 1.75% ~ 6.42 %，批间准确度为 102.03 %~106.15%，批间精密度为 RSD%为 2.83%~ 10.95%，符合生物样本分析检测要求。
2.3.4 提取回收率
配制质量浓度分别为 0.390、8.20、32.8 ng· mL-1 的质控血浆样品，每样 6 份，与相应质量浓度标准品溶液以水代替血浆同法配制的 6 份样品比较，计算提取回收率，3 个质量浓度尼群地平的 提 取 回 收 率 分 别 为 (106.14 ±4.82) % ，(103.93±3.22) %和 (101.53±4.50) %，相对标准偏差 RSD%分别为 4.53%、3.10%和 4.43%，平均提取回收率为 103.89%，相对标准偏差 RSD%为 2.22%，回收对尼群地平及内标氘代尼群地平的影响较小，符合生物样本分析检测要求。
2.3.5 基质效应
处理低、中、高 (0.390、8.20、32.8ng·mL-1) 3 个质量浓度的尼群地平基质样品，每浓度各 6 份，与相应浓度标准品以水代替血浆照“血浆样品的预处理”方法操作处理后的 6 份样品进样比较，计算内标归一化基质效应，尼群地平各质量浓度的内标归一化基质效应分别为 (112.85± 4.20) % ， ( 111.56 ±4.42) % 和 ( 111.84 ± 4.23) %，相对标准偏差 RSD%分别为 3.72%、 3.96%、3.78%，平均内标归一化基质效应为 112.20%，相对标准偏差 RSD%为 0.61%，基质对尼群地平及内标氘代尼群地平的影响较小，满足生物样品分析检测要求。
2.3.6 稳定性
取低、中、高 3 个质量浓度 (3.90、82.0、 328ng·mL-1) 的质控标准工作液各 15 份，室温氮气吹干，加入 100 μL 空白血浆，涡匀，分别考察室温避光放置 10 h 和室温不避光放置 3 h 及处理后放置 7d 的稳定性。结果所有样品相对偏差 RE%在-10.37%~8.21%范围内，RSD%在 1.23%~ 8.49%范围内，表明尼群地平血浆样本在上述条件下均稳定。
2.4 临床试验
试验方案实施前经伦理委员会审查批准，16 名健康志愿者体格检查、心电图检查和实验室检查均正常。试验前两周至试验结束未使用影响尼群地平片体内过程或安全性评价的药物或食物，自愿签署知情同意书，采用自身交叉对照设计，将志愿者随机分为空腹给药组和餐后给药组，空腹给药组服药前禁食 10h，餐后给药组服药前禁食 10h 并于服药前 30 min 内进食高脂高热量餐，服药剂量为 10 mg，清洗期 7 天，服药前 (1 h 内) 及服药后 0.5 h、0.75 h、1 h、1.25 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 采集静脉血，所采血液在 3000 r·min-1，2～ 8℃条件下离心 10 min，然后分离血浆样品，于- 80 ℃冰箱中保存待测 (全血采集和离心分装等均在避光环境下进行操作)。
2.5 统计学处理
采用 DAS3.3.0 软件非房室模型计算药代动力学参数，对药动学参数 AUC 和 Cmax 经对数转换后进行多因素方差分析和双单侧 t 检验，以 AUC 和 Cmax 的 90%置信区间 (90%CI) 评价尼群地平片的生物等效性。以多因素方差分析得到的残差 (mean square error，MSE) [7]，采用 DAS3.3.0 软件计算尼群地平空腹服药及餐后服药 Cmax、AUC0-t、 AUC0-∞ 的个体内变异和个体间变异。
3 结果
3.1 药-时曲线
志愿者餐后或空腹服用尼群地平参比制剂和受试制剂平均血药浓度-时间曲线，见图 2。
3.2 药动学参
数采用 DAS3.3.0 软件计算得到的药代动力学参数结果见表 1。
3.3 生物等效性评价
尼群地平片空腹状态或餐后状态服药后 Cmax、 AUC0 -t、 AUC0 -∞ 的 90% CI 结 果 见 表 2。 Cmax、 AUC0-t、AUC0-∞ 的 90%CI 均超出 80%~ 125%，尼群地平两制剂不符合生物等效性假设，餐后服药药动学参数 AUC 在个体间差异有统计学意义(P<0.05)，空腹服药药动学参数 Cmax 在个体间、 AUC 在个体间及药物间差异有统计学意义 (p< 0.05)。空腹服用尼群地平片后 Cmax、AUC0-t、AUC0-∞ 个体内变异为 24.43%、22.87%、22.38%，个体间变异为 39.71%、42.88%、43.84%;餐后服用尼群地平片后 Cmax、AUC0-t、AUC0-∞ 个体内变异为 64.20% 、 21.03% 、 23.06% ， 个 体 间 变 异 为 52.93%、57.60%、68.60%。
4 讨论
药动学参数 Cmax、AUC 个体间差异有统计学意义，可能与尼群地平药物本身个体间变异有关 [8]，空腹状态或餐后状态服药后药动学参数 Cmax、AUC 置信区间均超出 80%~ 125%，两个企业生产的尼群地平片生物不等效，说明受试制剂与原研药仍存在一定差距，提示后续需要继续优化尼群地平片处方、改善制剂工艺，以期获得等效性结果。
参考文献：
[1] 赵娟,施润杰,张煌,等. 不同厂家尼群地平片有关物质的对比研究[J]. 中西医结合心血管病杂志,2017, 5 (22) :87-88.
[2] 孙加琳,宋俊科,邢程,等. 临床常用尼群地平片在大鼠体内药代动力学比较研究究 [J]. 中国临床药理学与治疗学, 2012, 17 (7) :755-760.
[3] 杜爽,梁毅. 仿制药一致性评价与全面质量管理一体化的解析[J]. 中国卫生政策研究, 2017, 10 (8) :40-43.
[4] 李自强,黄宇虹,王保和,等.FDA,EMA 和 CFDA 关于高变异药物生物等效性研究指南比较[J]. 中国新药杂志, 2017, 26 (1) :7- 13.
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